FAQ(LS)

使用ELISA试剂盒的小提示

1在使用ELISA试剂盒过程中,提出疑问前,请先阅读小提示
跟踪库存,包括收货时间和使用时间。
试剂盒是按照严格的质量标准进行批次生产的。盒子里的每瓶试剂的使用都是达到最优化的。鉴于这种原因,不能混合使用不同批次盒子的试剂是非常重要的。
使用试剂盒之前,先回温2~3个小时。在这段时间内,把所有的试剂都拿出盒子。酶标板在密封的包装袋内进行回温。
每天监测实验室的温度。
所有解冻的样品在稀释前,必须完全混合。把样品加到酶标板之前,把样品彻底混合和进行稀释。
稀释样品时,使用正向移液器加样的方法;添加试剂(如酶标物、底物和终止液)时,使用反向移液器加样的方法。
当使用移液器加入样品或试剂到空白酶标板时,将移液器放在孔中较低的位置,贴住孔壁。
必须按照试剂盒的说明书的洗板次数来进行洗板。吸取洗液并且注满第一行,然后倒掉板里面余下的液体。重复这个洗板步骤多次达到说明书的次数要求为止。确保最后一次洗板后,把酶标板放在吸水纸上进行拍板,把孔中的水珠吸干。
不要让酶标板在洗板和加试剂的时间里变干燥。
使用无菌和洁净的容器来装试剂。仔细的计算出做完这次实验需要使用试剂的量。不要把试剂倒回储存的瓶子里。我们建议使用废液瓶来装多余的试剂,在处理的时候,可以把污染的风险降到最低。如果你必须重复使用一些加样槽,那么每种试剂都必须使用一个储液瓶,并且在上面进行标记。使用完毕,用去离子水或蒸馏水对储液瓶进行彻底的清洗和冲洗。
酶标板的孵育时间必须尽可能地精确。加入对照品到酶标板时,一定要连贯。我们要求:先加入对照品,再加入样品。
做实验时,必须确保实验用水是纯净水或去离子水,因为水质对实验非常重要。
加入终止液后,要迅速把酶标板放到酶标仪进行读取结果。读取结果前,用不含棉绒纸擦一下板孔的底部,确保没有板底外部没有水分和手指印来干扰结果。
一定要保证所有的实验室仪器设备都是洁净的和维护良好的。根据仪器的操作规程来维护仪器。

本底高或者显色过度的情况

1可能的原因:不同批次的试剂进行混合使用,试剂被污染或者准备不正确
保证每个步骤都使用正确的试剂,工作液准备正确和没有发生污染。
2可能的原因:实验室的环境温度或者孵育温度过高
保持环境温度在18–25°C之间。避免靠近热源、阳光直射或排气口进行实验操作。检查培养箱的温度。
3可能的原因:酶标仪发生故障或者空白检测不正常;如果OD值升高,而液体的颜色不深,这是一个可能的原因。
用校准酶标板和检查灯是否直线发光来确定酶标仪正常运行。确定空白检测过程,如果有合适的话,再做空白检测。
4可能的原因:底物变质了
加入底物之前,保证底物的颜色是浅色的。
5可能的原因:使用质量不好的水来洗板或者准备洗液
检查水的质量。如果水质有问题,尝试更换一个水源,例如瓶装的蒸馏水,来进行洗板或者准备洗液。
6可能的原因:洗板机的洗液系统更换了一个新的程式
保证每个独立的洗液都做好标签。更换洗液的时候,要完全加满。
7可能的原因:洗板机的洗液系统被微生物污染了
清洗受到微生物污染的洗液系统时,使用蒸馏水或纯净水稀释的漂泊剂(10%浓度)来冲洗。使用洗液系统前,用洗板液充满整个系统。如果污染严重,就要把管路更换。
8可能的原因:洗板不干净或者洗板机不正常工作
尝试使用试剂盒要求的最大清洗次数来进行洗板。保证每次加入的洗液为350ul/孔。核实洗板机正常运行。如果任何一个出液孔出现加液、吸液异常的,要联系工程师进行维修。
9可能的原因:维护后的洗板机仍然不正常工作
检查洗板机,专门检查它的针孔是否干净。

显色不足

1可能的原因:加样槽重复使用
每次实验时,都要使用一个新的加样槽
2可能的原因:酶标板失效或者仓促使用没有充分回温
确保冷藏的酶标板包装良好,保持良好的稳定性。避免酶标板回温的时候,水珠凝结在酶标板上。如果部分板条使用了,必须在使用了的孔上做好标记避免重复使用;用封板膜盖住它们,并且尽快把剩下没使用的板条用完。不要让使用过的酶标板和其它酶标板一起保存,包括使用同一包干燥剂。
3可能的原因:发生过度的使用
检查使用记录——从冰箱拿出来使用多少次。检查试剂盒是否放在平台上或者其它位置过长时间或者放在高温的地方。
4可能的原因:阳性对照被稀释了(仅限于间接的形式)
不要随意稀释对照品,除非说明书有特别要求。
5可能的原因:使用错误的波长来读取结果,或者酶标仪运行出错
确定正确的波长来进行读数。用校准酶标板和检查灯是否直线发光来确定酶标仪正常运行。
6可能的原因:使用错的酶标物,酶标物准备出错或者变质
保证使用的酶标物是来自同一个试剂盒,所有的酶标物都是来自同一批次的试剂盒。如果需要准备酶标物工作液,确保浓缩液和稀释液混合的体积准确。不要太早准备工作液,而且不要保存没有用完的工作液作以后使用。如果不需要准备酶标物工作液,确保取出实验所需的量立即使用,不能回收多余的溶液到储液瓶中。
7可能的原因:试剂过期或者混合不同批号的试剂
核对好产品的有效期和批号
8可能的原因:试剂和酶标板太低温了
保证酶标板和试剂在使用前从冰箱取出后,所有组成部分都拿出盒子,放置最少2~3小时,让它们回复到室温状态。
9可能的原因:孵育时间太短
按照说明书的要求时间来孵育酶标板。每块板都必须独立地计时,确保孵育时间准确。
10可能的原因:实验开始后,孔变干燥了
没有打断地完成所有实验步骤。不允许酶标板孔在洗板和加试剂之间的过程中变干燥。
11可能的原因:进行了太多次数的洗板
在操作说明书要求的次数范围内进行洗板。尝试按照最低要求洗板次数进行洗板。
12可能的原因:洗板机的洗液系统被微生物污染了或者洗板机的洗液系统更换了一个新的程式
清洗受到微生物污染的洗液系统时,使用蒸馏水或纯净水稀释的漂泊剂(10%浓度)来冲洗。使用洗液系统前,用洗板液充满整个系统。保证每个独立的洗液都做好标签。更换洗液的时候,要完全加满。
13可能的原因:洗液准备错误或者使用了错误的洗液
保证使用试剂盒配套的洗液并且按照说明书正确地准备。对每种洗液做好标记,避免使用错误的洗液。

阳性对照或阴性对照值高或低

1可能的原因:实验室温度或者孵育温度过低
保存室温在 18°–25°C。避免在空调出风口进行实验操作。检测培养箱的温度。
2对照值高的原因:阴性对照被污染了
一定要先加阴性对照,后加阳性对照
3对照值高的原因:阴性对照孔被阳性对照品污染了
洗板时,不要让孔中的液体溢到其它孔中。
4对照值低的原因:阳性对照品被微生物污染了
用新的对照品重新进行实验

假阳性结果

1对照值低的原因:检测试剂的体积较少
确保移液枪吸头与移液枪匹配。清除移液枪咀的堵塞物。校准移液枪。
2可能的原因:使用了溶血或者凝血的样品
用正常的样品重新进行实验

不显色

1可能的原因:加入酶标物时,液体附在孔壁上
实验多道移液器放在孔中较低的位置添加酶标物。
2可能的原因:酶标板孔被酶标物污染了
避免接触孔壁和孔边
3可能的原因:使用了错误的酶标物,酶标物准备错误或已经变质
保证使用的酶标物是来自同一个试剂盒,所有的酶标物都是来自同一批次的试剂盒。如果需要准备酶标物工作液,确保浓缩液和稀释液混合的体积准确。不要太早准备工作液,而且不要保存没有用完的工作液作以后使用。如果不需要准备酶标物工作液,确保取出实验所需的量立即使用,不能回收多余的溶液到储液瓶中。

板内重复性差

1可能的原因:样品没有加入稀释液中(仅限于间接类型)
确定样品加入了稀释液
2可能的原因:添加试剂的顺序出错或者漏了一些实验步骤
认真阅读试剂盒的说明书,再重新进行实验
3可能的原因:样品中的抗体分布不均匀
如果冻存或冷藏的样品需要解冻,确保它在稀释前充分混合。稀释好的样品也需要在加到酶标板之前充分混合。
4可能的原因:洗板不连续或者洗板机不正常工作
确定洗板机正常工作。如果其中的出液口堵塞或者j加液/吸液异常,请让工程师及时维修。

板间重复性差

1可能的原因:多道移液枪工作异常
保证移液枪已经校准好,而且枪头与其相匹配,不漏气。确定移液枪的所有枪咀洗液体积和排液体积相等。
2可能的原因:添加样品、对照品或者试剂到酶标板的时间过长
保证迅速地准备好所有的实验材料和试剂。实验多道移液枪加入试剂,让试剂同时加入多个孔中。把对照品和样品整理好,用多道移液枪同时把它们加到酶标板孔中。
3可能的原因:使用不同批号的试剂进行实验
如果同时做两个不同批号的试剂盒的实验,一定要对所用的物品做好标记,入加样槽等,才能保证所用的试剂都是来源于同一个批号。
4可能的原因:试剂盒里面的对照品和样品的温度不同
保证有足够的时间让样品稀释液、样品和对照品都放在试剂盒外回复到室温。体积大的溶液需要更长的时间进行回温。如果使用水池来让试剂进行回温,确保水处于室温状态,不要使用温水对对照品、样品或稀释液进行回温。
5可能的原因:移液枪工作异常
保证移液枪已经校准好,而且枪头与其相匹配,不漏气。确定移液枪的所有枪咀洗液体积和排液体积相等。